粗糙脈孢菌順序四分子分析

 一、實驗材料：

粗糙脈孢霉（lys+ 野生型）Neurospora crassa  CCTCC AF 2014012

粗糙脈孢霉（lys- 缺陷型）Neurospora crassa CCTCC AF 2014014

二、粗糙脈孢霉的性質(zhì)與生活史：

粗糙脈孢霉屬于真菌中的子囊菌綱，是低等的真核生物。每一菌絲細(xì)胞中含有幾十個細(xì)胞核。是遺傳分析好材料:子囊孢子是單倍體，其表型直接反應(yīng)其基因型；一次只分析一個減數(shù)分裂的產(chǎn)物；體積小，易培養(yǎng)，繁殖快，一次雜交就能產(chǎn)生大量的后代，便于獲得正確的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果；能進(jìn)行有性生殖，其染色體的結(jié)構(gòu)和功能類似于高等動植物；更加重要的是，子囊孢子在子囊中的線性排列順序與減數(shù)分裂中期染色體在赤道板兩側(cè)的排列順序相同，這就是粗糙脈孢霉成為了遺傳分析的好材料。

三、著絲粒作圖與遺傳分析：

利用四分子分析法，測定基因與著粒間的距離稱為著絲粒作圖。

著絲粒作圖是基于這樣的事實：減數(shù)分裂中在同源染色體的一對非姊妹染色單體的著絲粒和某雜合基因座間有沒有發(fā)生交換，和其產(chǎn)物四分子中的等位基因在排列方式上是不同的。可分為兩種：

四、實驗步驟：

1. 雜交接種與培養(yǎng)：

野生型菌株（Lys+，A）ⅹ缺陷型（Lys-，a）

2. 壓片觀察子囊：（注意觀察時期）

1）將附有子囊果的濾紙放入裝有來蘇爾溶液的培養(yǎng)皿中

2）取一張載玻片，滴1-2滴來蘇爾，用接種針將子囊果挑出，放在載玻片上

3）蓋上另一張載玻片，用手指壓片，將子囊果壓破

4）顯微鏡觀察，統(tǒng)計各種類型子囊的數(shù)量，每人統(tǒng)計200個左右的子囊

教學(xué)建議：

五、教學(xué)建議

粗糙脈孢霉培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）

馬鈴薯浸取液1L

[注] 馬鈴薯浸取液：取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1.0升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1.0升。

葡萄糖20g

瓊脂15g

自然pH

按上述配方配制PDA培養(yǎng)基，也可以通過試劑公司購買合成的PDA培養(yǎng)基，按說明書配制。

粗糙脈孢霉雜交培養(yǎng)基

斜面的配制：按比例取用上述培養(yǎng)基，加入瓊脂后需加熱沸騰至瓊脂完全溶解于馬鈴薯浸取液中，然后分裝至試管。試管規(guī)格：18*180，每支試管加入10ml上述瓊脂完全溶解的培養(yǎng)基液體。121度，滅菌20min。滅菌完成后

熱迅速加入100ul賴氨酸(100mg/ml)溶液至每支試管，混勻后擺制斜面。

賴氨酸溶液的配制方法：取0.5g賴氨酸粉末溶解于5ml無菌水中,待完全溶解后取0.22um孔徑的過濾器進(jìn)行過濾除菌后備用。

最佳保存條件：不用于實驗時，可于室溫保存2周左右。