Ames氏致突變和致癌實驗

 實驗材料：

菌株：鼠傷寒沙門氏菌突變型TA97（CCTCC AB2014173），TA98（CCTCC AB204062），TA100（CCTCC AB204063），TA102（CCTCC AB2014174）；

培養基：LB培養基，底層葡萄糖基本培養基，表層瓊脂培養基（含10% 0.5mmol組氨酸/生物素溶液，2ml/管）；

溶液、試劑及待測物質：濾紙片，氨芐青霉素溶液（8mg/ml），四環素溶液(8mg/ml)，結晶紫溶液(1mg/ml)，秋水仙堿，亞硝酸鈉，丙烯酰胺，無菌水。

實驗步驟：

1.鑒定實驗

（1） 組氨酸營養缺陷（his-）實驗

1.1 分別制備底層葡萄糖基本培養基平板和含有0.5mmol組氨酸/生物素溶液（0.2ml/皿）的底層葡萄糖基本培養基平板；

2.2 用無菌棉簽蘸取TA97、TA98、TA100和TA102菌懸液，分別劃線接種于含組氨酸和不含組氨酸的平板上；

2.3 將平板倒置放入37℃培養箱培養48h，觀察菌株生長情況。若菌株只在添加微量組氨酸的平板上生長，而在不含組氨酸的平板上不能生長，則菌株為his-型菌株。

（2）紫外線敏感實驗（ΔuvrB實驗）

2.1 制備含有0.5mmol組氨酸/生物素溶液（0.2ml/皿）的底層葡萄糖基本培養基平板，用無菌棉簽分別蘸取TA97、TA98、TA100和TA102菌懸液在平板上平行劃線；

2.2 待菌液浸干后，打開皿蓋，用錫箔紙遮蓋平板的一半，置于15W紫外燈下照射15s；

2.3 蓋上皿蓋，置37℃避光培養27h，觀察菌株生長情況。只在未經照射一側的

平板上生長的菌株為ΔuvrB型菌株。

（3）抗氨芐青霉素實驗（R因子-抗氨芐青霉素實驗）；

3.1 吸取TA97、TA98、TA100和TA102菌懸液0.1ml分別放入盛有2ml表層培養基的試管中（預先加熱融化后45℃保溫），搖勻后傾倒在底層葡萄糖基本培養基平板上，并使其分布均勻；

3.2 待瓊脂凝固后，將一直徑約1cm的無菌濾紙片貼在平板上，然后在濾紙片上滴加8mg/ml氨芐青霉素溶液20μl，倒置于37℃培養24h，觀察濾紙片周圍是否出現抑菌環。

（4）抗四環素實驗（質粒pAQ1菌株實驗）

4.1 平板制備同3.1

4.2 待瓊脂凝固后，將一直徑約1cm的無菌濾紙片貼在平板上，然后在濾紙片上滴加8mg/ml四環素溶液20μl，倒置于37℃培養24h，觀察濾紙片周圍是否出現抑菌環。

（5）結晶紫敏感實驗（深粗糙突變，rfa）

5.1 平板制備同3.1

5.2待瓊脂凝固后，將一直徑約1cm的無菌濾紙片貼在平板上，然后在濾紙片上滴加1mg/ml結晶紫溶液20μl，倒置于37℃培養24h，觀察濾紙片周圍是否出現抑菌環。

2.致癌物檢測（平板滲入法）

（1）制備底層葡萄糖基本培養基平板，置于37℃培養箱中過夜；

（2）菌液準備：分別挑取適量四種缺陷菌株，接種于LB液體培養基中振蕩培養10~12h，使菌液濃度達到（1~2）×109個/ml；

（3）表層培養基試管置于45℃水浴備用，依次加入TA97、TA98、TA100和TA102菌懸液0.1ml和待檢測致癌物質0.1ml；

（4）表層培養基混勻后，迅速傾倒在底層葡萄糖基本培養基平板上，平放凝固

后，倒置于37℃培養箱48h后觀察結果，計數平板上的回變菌落數。

實驗結果：

1.鑒定試驗

各菌株的鑒定結果如下：

TA97：組氨酸缺陷，結晶紫敏感，紫外線敏感，氨芐青霉素不敏感，四環素敏感；

TA98：組氨酸缺陷，結晶紫敏感，紫外線敏感，氨芐青霉素不敏感，四環素敏感；

TA100：組氨酸缺陷，結晶紫敏感，紫外線敏感，氨芐青霉素不敏感，四環素敏感；

TA102：組氨酸缺陷，結晶紫敏感，紫外線不敏感，氨芐青霉素不敏感,四環素不敏感。

綜合以上結果，本實驗選用的鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102均符合Ames實驗要求。