小鼠胚胎干細胞(E14)

小鼠胚胎干細胞(E14)特性：

1） 來源：小鼠，胚胎內細胞團

2） 形態(tài)：球形克隆

3） 含量：>1x106 個/mL

4） 污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

5） 規(guī)格：T25 瓶或者1mL 凍存管包裝

細胞接受后的處理：

1）收到細胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發(fā)給我們。

2）請先在顯微鏡下確認細胞生長狀態(tài)，去掉封口膜并將T25 瓶置于37℃培養(yǎng)約2-3h。

3）棄去T25 瓶中的培養(yǎng)基，添加6ml 明舟生物（mingzhoubio）附帶的完全培養(yǎng)基。

4）如果細胞長滿（90%以上）請及時進行細胞傳代，傳代培養(yǎng)用6ml 明舟生物（mingzhoubio）附帶的完全培養(yǎng)基。

5）接到細胞次日，請檢查細胞是否污染，若發(fā)現(xiàn)污染或疑似污染，請及時與我們取得聯(lián)系。

小鼠胚胎干細胞(E14)用途：僅供科研使用。

明舟生物（mingzhoubio）的小鼠胚胎干細胞(E14)培養(yǎng)操作規(guī)程，供參考

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）mES 完全培養(yǎng)液配方（600 ml）： DMEM (Invitrogen 12430) 497 ml ，ES 級FBS(biochrom S4115) 90 ml， Glutamax (Invitrogen 35050) 6 ml ，NEAA (Invitrogen11140) 6 ml ，LIF (Millipore ESG1107) 60μl（終濃度為1000U/ml），β-Mer(Invitrogen 21985) 1.5 ml。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。

二．細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL 細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL 培養(yǎng)基的15ml 離心管中混合均勻。在1000RPM 條件下離心4 分鐘，棄去上清液，加入1mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS 潤洗細胞1-2 次。

2. 加2ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml 此細胞的培養(yǎng)基終止消化。

3. 輕輕吹打后吸出，移入15ml 離心管中，在1000RPM 條件下離心4 分鐘，棄去上清液，加入1mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 移入到事先準備好的含有5ml 培養(yǎng)基的T-25 培養(yǎng)瓶中或含有14ml 培養(yǎng)基的T-75 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，先要消化處理并進行細胞計數(shù)。消化方法按照細胞傳代方法的1-3 步驟進行，最后的重懸液使用血清。懸浮細胞直接計數(shù)后離心，用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO 后迅速混勻，按每1ml 的數(shù)量分配到凍存管中。明舟生物（mingzhoubio）按每個凍存管細胞數(shù)目大于1X106 個細胞凍存。

注意事項：

1. 收到細胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

2. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。