小鼠胚胎細胞(NIH/3T3)

小鼠胚胎細胞(NIH/3T3)介紹：與原始的隨機交配3T3 和近交系BALB/c 3T3 建株方法一樣，NIH/3T3，是從NIHSwiss 小鼠胚胎培養(yǎng)物中建立的高度接觸抑制的連續(xù)細胞株。為了培育在形態(tài)學特征上更適合于進行轉化分析的亞株，建立的NIH/3T3 細胞株又進行了五輪以上亞克隆。小鼠胚胎細胞(NIH/3T3)對DNA 轉化及轉染研究十分有用。檢測表明肢骨發(fā)育畸形病毒(鼠痘)陰性。

小鼠胚胎細胞(NIH/3T3)特性：

1） 來源：胚胎

2） 形態(tài)：成纖維細胞

3） 含量：>1x106 個/mL

4） 污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

5） 規(guī)格：T25 瓶或者1mL 凍存管包裝

運輸和保存：使用含有優(yōu)質(zhì)胎牛血清的2ml 凍存管發(fā)送存活細胞。收到細胞后，可在1000RPM，常溫條件下，離心5min 后，于潔凈操作臺棄去上清，加入推薦使用的培養(yǎng)基后轉移至10cm 培養(yǎng)皿或者T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，傳代達到細胞生長狀態(tài)良好時，再進行凍存。具體操作見細胞培養(yǎng)步驟。

小鼠胚胎細胞(NIH/3T3)用途：僅供科研使用。

小鼠胚胎細胞(NIH/3T3)培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備DMEM 培養(yǎng)基(DMEM，GIBCO，貨號11965-092)，北美胎牛血清，15%，1% PS。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37 攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。

二．細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL 細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入4mL 培養(yǎng)基混合均勻。在800-1000RPM 條件下離心4-5 分鐘，棄去上清液，補加1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，補加培養(yǎng)基至6ml。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS 潤洗細胞1-2 次。

2. 加1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2ml 完全培養(yǎng)基終止消化。

3. 輕輕打勻后吸出，在1000RPM 條件下離心5 分鐘，棄去上清液，加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按1：2 到1:5 比例分到新的含6ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。

下面T25 瓶為例；

1．細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗瓶底1-2 次后加入1ml 胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml 完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2．1000RPM 離心5 分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO 至最終濃度為10%。加入DMSO 后迅速混勻，按每1ml 的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。明舟生物（mingzhoubio）按每個凍存管細胞數(shù)目大于1X106 個細胞凍存。

3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，至少2 個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

注意事項：

1. 收到細胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

2. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。